1.一种用于检测硫化氢的近红外荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的分子式为C₄₂H₃₀N₂O₅S₂，结构式如下：。2.权利要求1所述用于检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，合成路线如下：具体包括以下步骤：（1）向N,N-二甲基甲酰胺中加入间氨基酚和1-溴-3-氯丙烷，混合均匀，在N₂保护下回流反应，通过薄层层析监测合成产物，反应结束后萃取混合物，经水洗、干燥得到化合物1粗品，再采用柱色谱对化合物1粗品进一步分离即得化合物1；（2）将步骤（1）制备的化合物 1和邻苯二甲酸酐溶于甲苯中，于搅拌条件下，升温至90~110℃并回流至固体生成，经抽滤、重结晶得到化合物2粗品，再采用柱色谱对化合物2粗品进一步分离，经干燥即得化合物2；（3）将步骤（2）制备的化合物2和1,6-二羟基萘溶于甲苯中，在催化剂甲磺酸作用下搅拌反应后得到反应液，将反应液经萃取、水洗、干燥后得到化合物3粗品，再采用柱色谱对化合物3粗品进一步分离，经干燥即得化合物3；（4）将化合物3、和4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中并搅拌均匀，然后向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的二氯甲烷溶液，于氮气保护下反应得到粗品，经柱色谱分离、真空干燥即得所述荧光探针。3.根据权利要求2所述用于检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中氨基酚和1-溴-3-氯丙烷的摩尔比为1:（3~4）。4.根据权利要求2所述用于检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）中化合物1和邻苯二甲酸酯的摩尔比为1:（1~2）。5.根据权利要求2所述用于检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤（3）中化合物2和1,6-二羟基萘的摩尔比为1:（2~3）。6.权利要求1所述荧光探针用于硫化氢的检测。

一种用于检测硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用技术领域本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种用于检测硫化氢(H₂S)的近红外荧光探针及其制备方法和应用。背景技术H₂S是继NO、CO之后被发现的第三种生物体内源性产生的活性物质，存在于神经系统、内分泌系统、呼吸系统、心脑血管系统等中，是调节各项生理活动的气体递质分子，对维持机体正常的生命活动发挥着重要作用。而H₂S是一种毒性化学污染物，长时间接触会伤害眼睛或呼吸系统，过量吸入会使人失去意识、呼吸衰竭、心脏骤停甚至死亡。因此实现对其快速、灵敏、准确的检测成为环境监测和生物医学的迫切需要。传统测定硫化氢含量的方法有很多，如基于亚甲蓝的分光光度法、基于纳米管的电化学检测法、色谱法、极谱法和硫离子选择性电极法等。基于亚甲蓝的分光光度法是根据朗伯-比耳定律，得出H₂S的浓度与透过光的强度的线性关系，但受仪器的灵敏度的限制，H₂S最低浓度的测量受限；基于纳米管的电化学检测法工作原理是薄膜接触H₂S气体后电导率发生变化，是一种便携式H₂S气体监测器最常用的方法，但是这类监测器往往依赖于半导体金属氧化物或金属，因此仪器较昂贵，此外这类传感器操作温度较高、灵敏度低、使用寿命短、易受其他气体(如NH₃和NO_x)的干扰；色谱法对于分气体样品具有其独特的优势，但是它对于样品具有破坏性，不适用于生物样品的实时分析；极谱法是检测H₂S的一种新颖方法，它包括阳极、阴极和电解液。电解液用H₂S可透过的聚合物膜进行保护。它具有较高的灵敏度和快速的响应时间，被用于细胞、组织和器官中H₂S的检测，但其可信度和准确性面临巨大挑战；硫离子选择性电极法常用于检测血液和细胞培养介质中的H₂S，此方法易操作、价格便宜，但硫离子选择性电极只对S^2-有响应，而自由的H₂S的离解需要在强碱性和完全无氧的条件下实现，需要大量的样品并且只能实现离线检测。荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操纵简单、检出限低等优点，加上近红外光能穿透组织，对样品的损伤小，能够减少生物自身荧光的干扰，因此近红外光发射的荧光探针是检测H₂S的重要方法。发明内容为了克服现有技术中的问题，本发明提供了一种用于检测硫化氢的近红外荧光探针。该荧光探针对H₂S的特应性识别反应迅速，具有良好的选择性和较高的灵敏度，检测限低。本发明还提供了上述荧光探针的制备方法。同时，本发明还提供了上述荧光探针的应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种用于检测硫化氢的近红外荧光探针，其分子式为C₄₂H₃₀N₂O₅S₂，结构式如下：上述用于检测硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，合成路线如下：具体包括以下步骤：(1)向N,N-二甲基甲酰胺中加入间氨基酚和1-溴-3-氯丙烷，混合均匀，在N₂保护下回流反应，通过薄层层析监测合成产物，反应结束后萃取混合物，经水洗、干燥得到化合物1粗品，再采用柱色谱对化合物1粗品进一步分离即得化合物1；(2)将步骤(1)制备的化合物1和邻苯二甲酸酐溶于甲苯中，于搅拌条件下，升温至90～110℃并回流至固体生成，经抽滤、重结晶得到化合物2粗品，再采用柱色谱对化合物2粗品进一步分离，经干燥即得化合物2；(3)将步骤(2)制备的化合物2和1,6-二羟基萘溶于甲苯中，在催化剂甲磺酸作用下搅拌反应后得到反应液，将反应液经萃取、水洗、干燥后得到化合物3粗品，再采用柱色谱对化合物3粗品进一步分离，经干燥即得化合物3；(4)将化合物3、(即合成路线图中的化合物4)和4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中并搅拌均匀，然后向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的二氯甲烷溶液，于氮气保护下反应得到粗品，经柱色谱分离、真空干燥即得所述荧光探针。优选的，步骤(1)中氨基酚和1-溴-3-氯丙烷的摩尔比为1:(3～4)。优选的，步骤(2)中化合物1和邻苯二甲酸酯的摩尔比为1:(1～2)。优选的，步骤(3)中化合物2和1,6-二羟基萘的摩尔比为1:(2～3)。所述荧光探针用于硫化氢的检测，检测限为7.161×10^-8M。和现有技术相比，本发明的有益效果是：1.本发明荧光探针的二硫键与H₂S反应而断键，断裂的二硫键的巯基对羰基亲核进攻，释放出罗丹明染料分子单体，荧光强度增强近10倍且伴随明显的颜色变化，不受干扰离子的影响，实现了对H₂S的特应性识别响应；2.该探针在体系(PBS:DMSO＝1:1)中对H₂S反应迅速，具有良好的选择性和较高的灵敏度，检测限可达7.161×10^-8M。附图说明图1为实施例1中化合物3的核磁氢谱；图2为实施例1中化合物3的核磁碳谱；图3为实施例1制备的近红外荧光探针的核磁氢谱；图4为实施例1制备的近红外荧光探针的核磁碳谱；图5中(a)为实施例1制备的近红外荧光探针对H₂S随时间响应关系的紫外吸收光谱；(b)为最大吸收波长(603nm)吸光度随时间的变化曲线；图6中(a)为实施例1制备的近红外荧光探针对H₂S随时间响应关系的荧光光谱；(b)为最大发射波长(654nm)下的荧光强度随时间的变化变化曲线；图7中(a)为实施例1制备的近红外荧光探针随H₂S浓度不同的紫外吸收光谱变化；(b)为探针加入硫化氢前后的颜色对比图；图8中(a)为实施例1制备的近红外荧光探针随H₂S浓度不同的荧光光谱变化；(b)为最大发射波长(654nm)下的荧光强度随硫化氢浓度变化曲线图；图9为实施例1制备的近红外荧光探针在H₂S响应受pH值影响的荧光光谱；图10为实施例1制备的近红外荧光探针在H₂S响应受pH值影响的紫外吸收光谱；图11为不同离子与实施例1制备的近红外荧光探针的荧光光谱；图12为不同离子与实施例1制备的近红外荧光探针的紫外吸收光谱；图13为不同离子与实施例1制备的近红外荧光探针在波长654nm下的荧光强度柱状对比图；图14为实施例1制备的近红外荧光探针在紫外灯下所示颜色的变化；图15为实施例1制备的近红外荧光探针在日光所示颜色的变化。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明，但并不是对本发明的限制。实施例1本实施例荧光探针的制备方法包括以下步骤：(1)化合物1的制备向250mL圆底烧瓶中加入30.0mLDMF(N,N-二甲基甲酰胺)、18.0mL 1-溴-3-氯丙烷(182mmol)，5.0g间氨基酚(45.9mmol)，放入磁子，在氮气保护下快速搅拌并升温至70℃，于70℃下回流12h，冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，水洗3次，每次60.0mL去离子水，用无水硫酸钠干燥上层油相得粗品。再采用硅胶色谱柱(下同)进一步分离(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝18:1，体积比，下同)，真空干燥得白色固体4.02g，即纯品化合物1，收率为46％。合成路线如下：(2)化合物2的制备在100mL圆底烧瓶中加入2g化合物1(10.6mmol)，2.35g邻苯二甲酸酐(15.9mmol)和30mL甲苯，放入磁子，快速搅拌并升温至100℃，于100℃下反应10h得到化合物2粗品，将化合物2粗品进一步用柱色谱分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1)，旋蒸出溶剂，真空干燥，得到黄色纯品化合物2，收率为66.12％。合成路线如下：(3)化合物3的合成在50mL两口瓶中加入100mg化合物2(0.3mmol)、95mg的1,6-二羟基萘(0.6mmol)、8mL甲苯和800μL催化剂甲磺酸，搅拌均匀，在65℃氮气保护下反应2h，得到的反应液用二氯甲烷萃取，经水洗、硫酸钠干燥得到化合物3粗品，粗品经柱色谱分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1)，然后旋出溶剂，经真空干燥，得到红色纯品化合物3，收率为65％。化合物3的核磁氢谱和碳谱分别如图1-2所示。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.14(s,1H),8.34(d,J＝9.0Hz,1H),8.02(d,J＝7.3Hz,1H),7.75(dt,J＝14.3,6.9Hz,2H),7.34(d,J＝8.7Hz,1H),7.27(t,J＝8.4Hz,2H),7.14(s,1H),6.55(d,J＝8.7Hz,1H),6.13(s,1H),3.68–3.52(m,2H),3.21(s,2H),3.15(s,2H),3.07(s,2H),2.03(s,2H),1.81(s,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ169.39(s),157.65(s),153.40(s),147.20(d,J＝13.5Hz),144.79(s),136.24(s),135.99(s),130.45(s),126.81(s),125.01(s),124.71(s),124.49(s),123.94(s),122.16(s),119.52(s),118.51(s),117.87(s),109.90(d,J＝21.7Hz),107.19(s),105.06(s),85.01(s),56.50(s),49.58(s),49.11(s),27.22(s),21.68(s),21.14(s),19.03(s).合成路线如下：(4)近红外荧光探针的制备在50mL两口瓶中将60mg(0.13mmol)化合物3、38mg(0.14mmol)化合物4和20mg(0.16mmol)4-二甲氨基吡啶溶于5ml二氯甲烷，搅拌均匀后，于0℃下向其中缓慢加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)的二氯甲烷溶液(具体的，将100mg(0.52mmol)的EDC加入到5mL二氯甲烷中)，然后于氮气保护下在室温反应6h，得到粗品，经柱色谱分离(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝1:1)、真空干燥得到探针纯品，收率为52％。本实施例制备的荧光探针的核磁氢谱和碳谱分别如图3-4所示。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(d,J＝9.1Hz,1H),8.49(d,J＝4.4Hz,1H),8.38(d,J＝7.6Hz,1H),8.06(d,J＝7.3Hz,1H),8.00(d,J＝8.1Hz,1H),7.72–7.66(m,2H),7.61(dd,J＝17.3,6.5Hz,3H),7.58–7.52(m,3H),7.42–7.35(m,2H),7.18(d,J＝7.2Hz,1H),7.13–7.10(m,1H),6.79(d,J＝8.7Hz,1H),6.24(s,1H),3.22(dd,J＝12.4,7.2Hz,2H),3.17(d,J＝5.0Hz,4H),2.65–2.52(m,2H),2.11(d,J＝10.4Hz,2H),1.91(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.85(s),164.85(s),158.96(s),153.62(s),149.70(d,J＝14.1Hz),147.43(s),144.71(s),141.60(s),137.42(s),134.94(d,J＝9.9Hz),133.94(s),132.12(s),129.50(s),127.11(s),126.26(d,J＝15.1Hz),125.94(s),125.34(s),124.92(d,J＝4.1Hz),124.20(d,J＝3.4Hz),123.91(s),122.45(d,J＝7.7Hz),121.39(s),121.08(s),119.83(s),118.83(s),118.50(s),112.80(s),107.42(s),105.00(s),49.90(s),49.43(s),29.71(s),27.39(s),21.78(s),21.28(s),20.60(s).合成路线如下：本实施例制备的荧光探针的应用试验如下：1)检测用储备液的配置a.近红外检测H₂S探针样品溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)的配制：准确称取0.0071g(M＝706)Probe(指本实施例的荧光探针)溶于10.00ml二甲基亚砜，配成浓度为1.00×10^-3mol·L^-1的探针储备液。b.各种氨基酸及阴离子(具体为：(1)probe空白样、(2)碘化钾(I^-)溶液、(3)氰化钠(CN^-)溶液、(4)硫氰化钾(SCN^-)溶液、(5)醋酸钠(Ac^-)溶液、(6)磷酸钾(PO₄^3-)溶液、(7)氟化钾(F^-)溶液、(8)溴化钾(Br^-)溶液、(9)亚硫酸氢钠(HSO₃^-)溶液、(10)碳酸氢钠(HCO₃^-)溶液、(11)硫酸钠(SO₄^2-)溶液、(12)硫酸氢钠(HSO₄^-)溶液、(13)碳酸钠(CO₃^2-)溶液、(14)Gla、(15)亮氨酸(Leu)溶液、(16)异亮氨酸(Ile)溶液、(17)脯氨酸(Pro)溶液、(18)缬氨酸(Val)溶液、(19)半胱氨酸(Cys)溶液、(20)谷胱甘肽(GSH)溶液、(21)H₂S均用去离子水配置成浓度为1.00×10^-2mol·L^-1的溶液。c.PBS缓冲溶液(0.01mol·L^-1，pH＝7.4)的配制：母液配置：0.2mol·L^-1K₂HPO₄：称取78g K₂HPO₄·12H₂O溶于1000mL水中；0.2mol·L^-1K₂HPO₄：称取27.2g K₂HPO₄·2H₂O，溶于1000mL水中。0.2mol·L^-1PBS母液(pH＝7.4)：取19mL的0.2mol·L^-1K₂HPO₄，81mL 0.2mol·L^-1K₂HPO₄。然后取50mL 0.2mol·L^-1PBS溶液，加水稀释至1000mL即可。下述检测中使用的缓冲溶液均为：PBS(0.01mol·L^-1，pH＝7.4)和乙醇，PBS和乙醇的体积比为7:3，实验用水均为去离子水。2)检测分析取3mL缓冲溶液，加入30μL近红外荧光探针样品溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)，然后加入30μL的1.00×10^-2mol·L^-1的H₂S水溶液，检测吸光度在25min内的变化。测紫外吸收光谱的扫描参数，起点为300nm，终点为800nm，速度为快，间隔为1nm，结果如图5中(a)所示。由图5中(a)可以看出，探针在加入H₂S之后，体系的吸光度随时间的增加而增强，而且伴有红移现象；取603nm处的吸光度与时间变量作图，如图5中(b)所示，由图可以看出，体系的吸光度增长趋势随着时间的增长，逐渐缓慢，大约在25min左右，反应体系紫外强度达到平衡状态。取3mL缓冲溶液，加入30μL近红外荧光探针样品溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)，扫条只有探针的对比线，然后加入30μL的1.00×10^-2mol·L^-1的H₂S水溶液，检测荧光光谱在15min内随时间的变化，荧光的激发波长为600nm，激发狭缝宽度为2.5nm，发射狭缝宽度为2.5nm，结果如图6中(a)所示。由图6中(a)可以看出，探针在加入H₂S之后，体系的荧光强度随时间的增加而增强；取654nm处的荧光强度与时间变量作图，如图6中(b)所示，由图可以看出，体系的荧光强度增长趋势随着时间的增长，逐渐缓慢，大约在15min左右，反应体系荧光强度达到平衡状态。取3mL缓冲溶液，加入30μL近红外荧光探针样品溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)，然后加入不同当量的H₂S水溶液，检测吸光度，结果如图7中(a)所示。由图7中(a)可以看出，探针在加入不同浓度的H₂S之后，体系的吸光度随浓度的增加而增强，而且伴有红移现象，在5Equiv时达到饱和；溶液的颜色由淡红(左)变为蓝色(右)，如图7中(b)所示。取3mL缓冲溶液，加入30μL的1.00×10^-3mol·L^-1探针，加入不同当量的H₂S水溶液，摇匀，检测荧光光谱，结果如图8中(a)所示。由图8中(a)可以看出，探针在加入不同浓度的H₂S之后，体系的荧光强度随浓度的增加而增强；根据不同浓度下检测到的荧光强度值(654nm)做出图8中(b)的关系图：探针与H₂S在接近1:2当量的浓度下进行线性拟合，可得线性相关度为0.994，拟合方程为y＝227.64x+57.074，并通过计算，探针与H₂S反应的检出限为0.07161μM。取3mL不同pH缓冲溶液，加入30μL近红外荧光探针样品溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)，然后加入30μL的1.00×10^-2mol·L^-1H₂S溶液，测试荧光光谱和紫外吸收光谱，结果分别如图9、图10所示(具体的，图9和图10中，■代表空白探针在不同pH下的荧光强调，●代表加入探针加入硫化氢后荧光强度)，可以看出，在pH小于5的体系下探针中加入H₂S后，基本不响应；在pH大于10的体系下，探针不稳定，会自己分解，所以探针最适宜使用的pH范围为5～10。取3mL缓冲溶液，加入30μL近红外探针样品溶液(1.00×10^-3mol·L^-1)，然后加入(1)Probe、(2)I^-、(3)CN^-、(4)SCN^-、(5)Ac^-、(6)PO₄^3-、(7)F^-、(8)Br^-、(9)HSO₃^-、(10)HCO₃^-、(11)SO₄^2-、(12)HSO₄^-、(13)CO₃^2-、(14)Gla、(15)Leu、(16)Ile、(17)Pro、(18)Val、(19)100μMCys、(20)GSH和(21)H₂S，1h后，测荧光光谱和紫外吸收光谱，结果分别如图11、12所示。由图11可以看出，探针Probe在654nm处具有较弱的荧光发射，当加入H₂S后，探针Probe溶液的荧光发射显著增强，而加入其他阴离子(包括I^-，CN^-，SCN^-，Ac^-，PO₄^3-，F^-，Br^-，HSO₃^-，HCO₃^-，SO4^2-，HSO₄^-，CO₃^2-)和氨基酸(Gla，Leu，Ile，Pro，Val)的荧光光谱未发生显著改变。由图12可以看出，探针加入硫化氢后，600nm处最大吸收波长显著增强，而加入不同阴离子及氨基酸后的紫外吸收变化不大，尤其是含巯基氨基酸(GSH，Cys，Hcy)其紫外吸收光谱未发生显著改变。图13为探针加入硫化氢及不同阴离子、氨基酸后在最大发射波长654nm处荧光强度柱状对比图，我们可以看到，加入硫化氢前后654nm荧光强度增加8倍，由此我们认定该探针可以作为一种高选择性检测H₂S的荧光增强型探针。在日光灯和365荧光灯下进行颜色对比，结果分别如图14、图15所示，图中从左到右依次为(1)Probe、(2)100μM I^-、(3)100μM CN^-、(4)100μM SCN^-、(5)100μMAc^-、(6)100μMPO₄^3-、(7)100μM F^-、(8)100μM Br^-、(9)100μM HSO₃^-、(10)100μM HCO₃^-、(11)100μM SO₄^2-、(12)100μM HSO₄^-、(13)100μM CO₃^2-、(14)100μM Gla、(15)100μM Leu、(16)100μM Ile、(17)100μM Pro、(18)100μM Val、(19)100μM Cys、(20)100μM GSH和(21)100μM H₂S，由图14可以看出，探针Probe在加入H₂S后，日光下可以清楚看到溶液由无色变为蓝色，而其它他阴离子和氨基酸的溶液颜色不变，所以该探针可以用肉眼检测一定浓度H₂S是否存在；由图15可以看出，探针Probe在加入H₂S后，荧光灯下可以清楚看到H₂S溶液具有荧光，而其它他阴离子和氨基酸的溶液没有荧光，所以该探针可以用肉眼检测一定浓度H₂S是否存在。